多光子顯微鏡成像技術：多光子顯微鏡用于體內神經元成像的多種技術

與傳統的單光子寬視野熒光顯微鏡相比,多光子顯微鏡(MPM)具有光學切片和深層成像等功能,這兩個優勢極大地促進了研究者們對于完整活體大腦深處神經的了解與認識。2019年,Jerome Lecoq等人從大腦深處的神經元成像、大量神經元成像、高速神經元成像這三個方面論述了相關的MPM技術[1]。

想要將神經元活動與復雜行為聯系起來,通常需要對大腦皮質深層的神經元進行成像,這就要求MPM具有深層成像的能力。激發和發射光會被生物組織高度散射和吸收是限制MPM成像深度的主要因素,雖然可以通過增加激光強度來解決散射問題,但這會帶來其他問題,例如燒壞樣品、離焦和近表面熒光激發。增加MPM成像深度*好的方法是用更長的波長作為激發光。

另外,對于雙光子(2P)成像而言,離焦和近表面熒光激發是兩個*大的深度限制因素,而對于三光子(3P)成像這兩個問題大大減小,但是三光子成像由于熒光團的吸收截面比2P要小得多,所以需要更高數量級的脈沖能量才能獲得與2P激發的相同強度的熒光信號。功能性3P顯微鏡比結構性3P顯微鏡的要求更高,它需要更快速的掃描,以便及時采樣神經元活動;需要更高的脈沖能量,以便在每個像素停留時間內收集足夠的信號。

復雜 的行為通常涉及到大型的大腦神經網絡,該網絡既具有局部的連接又具有遠程的連接。要想將神經元活動與行為聯系起來,需要同時監控非常龐大且分布廣泛的神經元的活動,大腦中的神經網絡會在幾十毫秒內處理傳入的刺激,要想了解這種快速的神經元動力學,就需要MPM具備對神經元進行快速成像的能力。快速MPM方法可分為單束掃描技術和多束掃描技術。

單束掃描技術可以高速遍歷大視場(FOV)的神經組織

使用MPM對神經元進行成像時,通過隨機訪問掃描—即激光束在整個視場上的任意選定點上進行快速掃描—可以只掃描感興趣的神經元,這樣不僅避免掃描到任何未標記的神經纖維,還可以優化激光束的掃描時間。隨機訪問掃描(圖1)可以通過聲光偏轉器(AOD)來實現,其原理是將具有一個射頻信號的壓電傳感器粘在合適的晶體上,所產生的聲波引起周期性的折射率光柵,激光束通過光柵時發生衍射。通過射頻電信號調控聲波的強度和頻率從而可以改變衍射光的強度和方向,這樣使用1個AOD就可以實現一維橫向的任意點掃描,利用1對AOD,結合其他軸向掃描技術可實現3D的隨機訪問掃描。但是該技術對樣本的運動很敏感,易出現運動偽影。目前,快速光柵掃描即在FOV中進行逐行掃描,由于利用算法可以輕松解決運動偽影而被廣泛的使用。

圖1 基于AOD的體內新皮層L2 / 3神經元的雙光子成像[2]

快速光柵掃描有多種實現方式,使用振鏡進行快速2D掃描,將振鏡和可調電動透鏡結合在一起進行快速3D掃描,但可調電動透鏡由于機械慣性的限制在軸向無法快速進行焦點切換,影響成像速度,現可使用空間光調制器(SLM)代替。

遠程聚焦也是一種實現3D成像的手段,如圖2所示。在LSU模塊中,掃描振鏡進行橫向掃描, ASU模塊包括物鏡L1和反射鏡M,通過調控M的位置實現軸向掃描。該技術不僅可以校正主物鏡L2引入的光學像差,還可以進行快速的軸向掃描。想要獲得更多神經元成像,可以通過調整顯微鏡的物鏡設計來擴大FOV,但是具有大NA和大FOV的物鏡通常重量較大,無法快速移動以進行快速軸向掃描,因此大型FOV系統依賴于遠程聚焦、SLM和可調電動透鏡。

圖2 遠程聚焦雙光子成像系統的示意圖[3]多束掃描技術可以同時對神經元組織的不同位置進行成像

該技術如圖3所示。對兩個遠距離(相距大于1-2 mm)的成像部位,通常使用兩條獨立的路徑進行成像(圖3C,D);對于相鄰區域,通常使用單個物鏡的多光束進行成像(圖3E,F)。多光束掃描技術必須特別注意激發光束之間的串擾問題,這個問題可以通過事后光源分離方法或時空復用方法來解決。事后光源分離方法指的是用算法來分離光束消除串擾;時空復用方法指的是同時使用多個激發光束,每個光束的脈沖在時間上延遲,這樣就可以暫時分離被不同光束激發的單個熒光信號。引入越多路光束就可以對越多的神經元進行成像,但是多路光束會導致熒光衰減時間的重疊增加,從而限制了區分信號源的能力;并且多路復用對電子設備的工作速率有很高的要求;大量的光束也需要更高的激光功率來維持近似單光束的信噪比,這會容易導致組織損傷。

圖3 大面積成像技術

近年來,不同的MPM技術的發展拓寬了我們對神經組織的成像范圍,使得我們可以以更快的速度對大腦深處更多的神經元進行成像,這大大推動了神經科學的研究,使我們能夠對腦功能有更清晰的理解。

參考文獻

[1] Lecoq J, Orlova N, Grewe BF． Wide． Fast． Deep: Recent Advances in Multiphoton Microscopy of In Vivo Neuronal Activity[J]． The Journal of Neuroscience． 2019, 39(46): 9042–9052．

[2] Grewe BF, Langer D, Kasper H, Kampa BM, Helmchen F． High-speed in vivo calcium imaging reveals neuronal network activity with near-millisecond precision[J]． Nat Methods． 2010, 7:399-405．

[3] Botcherby EJ, Smith CW, Kohl MM, De?barre D, Booth MJ, Juskaitis R, Paulsen O, Wilson T． Aberration-free three-dimensional multiphoton imaging of neuronal activity at kHz rates[J]． Proc Natl Acad Sci USA． 2012, 109: 2919-2924．